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Gibt es einen Leitfaden für Anfänger zur Verwendung von CRISPR für die Transfektion einer Zelllinie mit einem GFP-Reporter?

Ich nehme an, Sie möchten eine stabile Zelllinie herstellen, die GFP exprimiert? In diesem Fall ist die Verwendung von CRISPR nicht erforderlich. Bei den meisten Protokollen haben Sie das Plasmid mit der GFP-Expressionskassette und einem Selektionsmarker für Säugetierzellen in Ihre interessierende Zelllinie transfiziert. Nach Kultivieren der Zellen mit dem Arzneimittelselektionsmarker haben Sie Ihre stabile Zelllinie von Interesse, die GFP exprimiert.

CRISPR ist eine gezielte RNA-gesteuerte Nuklease und nur dann nützlich, wenn Sie die GFP-Kassette an einer bestimmten Stelle im Genom einklopfen wollen. In diesem Fall würden Sie idealerweise chromosomale Sequenzen auf jeder Seite der Stelle haben, um die homologe Rekombination in den interessierenden Locus zu fördern. Das Screening würde sowohl die Selektionsstrategie mit Arzneimitteln als auch das Screening von Zellen auf die korrekt integrierte Region mit DNA-Sequenzierung umfassen.

Hier ist ein Protokoll zur Herstellung stabiler Zelllinien:

Generieren Sie stabile Zelllinien